Shokunin | Kuidas värvida kimonot (Mai 2024)
2015. aastaks oli geeni redigeerimine - võime muuta elusorganismi DNA järjestuses spetsiifilisi aluseid, kohandades põhiliselt selle geneetilist ülesehitust - keerulisest ja ebaefektiivsest laboratoorsest ettevõtmisest kliinilise rakenduse tippu. Edusamm, mida võimaldas CRISPR-Cas9-l tuntud molekulaarne tööriist, polnud olnud midagi hingematvat. See võimas tehnoloogia, mille leiutasid aga Ameerika teadlane Jennifer Doudna ja prantsuse teadlane Emmanuelle Charpentier ning mida viimistlesid Ameerika teadlane Feng Zhang ja tema kolleegid, tõi ka uue kiireloomulisuse pikaajalistesse aruteludesse geenitehnoloogia eetiliste ja sotsiaalsete mõjude üle. inimestel. Aastakümnete jooksul on ühel või teisel kujul esitatud palju küsimusi, näiteks seda, kas geenide redigeerimist tuleks kasutada inimeste haiguste raviks või selliste omaduste muutmiseks nagu ilu või intelligentsus. Need küsimused polnud enam siiski teoreetilised ja neile antud vastused mõjutasid inimese geneetikat väga reaalselt.
Varased katsed geneetilisi vigu parandada.
CRISPR-Cas9 tehnoloogia võeti kasutusele 2012. aastal, kuid idee kasutada geeni redigeerimist haiguste või tunnuste muutuste raviks oli palju vanem, ulatudes vähemalt 1950ndateni ja DNA avastamiseni. 20. sajandi keskpaiga geneetilise avastuse ajastul mõistsid teadlased, et DNA aluste jada antakse (enamasti) vanemale järglasele (enamasti) ustavalt ja et väikesed järjestuse muutused võivad tähendada erinevust tervise ja haiguse vahel. Viimaste tunnustamine viis möödapääsmatu oletuseni, et geneetilisi haigusi põhjustavate „molekulaarsete vigade“ tuvastamisel on vahendid nende vigade parandamiseks ja seeläbi haiguste ennetamiseks või tagasipöördumiseks. See mõte oli geeniteraapia põhiidee ja alates 1980. aastatest peeti seda molekulaargeneetikas pühaks graaliks.
Geeniteraapia geeni redigeerimise tehnoloogia arendamine oli aga järsk ülesmäge lahing. Suur osa varasematest edusammudest ei keskendunud DNA geneetiliste vigade parandamisele, vaid pigem nende tagajärgede minimeerimise katsele muteerunud geeni funktsionaalse koopia pakkumisega, kas genoomi sisestatud või kromosoomivälise üksusena (väljaspool genoomi). Kuigi see lähenemisviis oli mõnes olukorras efektiivne, oli see keeruline ja piiratud ulatusega.
Geneetiliste vigade tõeliseks parandamiseks pidid teadlased suutma tekitada DNA kaheahelalise katkemise täpselt soovitud asukohas enam kui kolme miljardis aluspaaris, mis moodustavad inimese genoomi. Kui see on loodud, saab kärg kaheahelalise purunemise tõhusalt parandada. Esialgse pausi tegemine genoomis täpses asukohas ja mitte kuskil mujal polnud aga lihtne.
DNA purustamine soovitud kohtades.
Enne CRISPR-Cas9 tulekut kasutati saidispetsiifiliste DNA kaheahelaliste katkemiste tegemiseks kahte lähenemisviisi: üks põhineb tsingi sõrme nukleaasidel (ZFN) ja teine transkriptsiooni aktivaatoritaolistel efektor-nukleaasidel (TALEN). ZFN-d on sulandvalgud, mis koosnevad DNA-d siduvatest domeenidest, mis tunnevad ära ja seostuvad spetsiifiliste 3 kuni 4 aluspaari pikkuste järjestustega. Spetsiifilisuse andmine näiteks 9-aluspaarilisele sihtjärjestusele eeldaks näiteks kolme ZFN-domeeni, mis on sulandatud paralleelselt. DNA-d siduvate domeenide paigutus on sulandatud ka järjestusele, mis kodeerib bakteriaalse nukleaasi Fok1 alaühikut. Kaheahelalise jaotuse hõlbustamine konkreetses kohas nõuab kahe ZFN-i sulandvalgu konstrueerimist - üks seonduks sihtkoha mõlemal küljel, vastupidistes DNA ahelates. Kui mõlemad ZFN-d on seotud, seostuvad läheduses olevad Fok1 subühikud üksteisega, moodustades aktiivse dimeeri, mis lõikab sihtmärgi DNA mõlemast ahelast.
TALENi sulandvalgud on kavandatud seonduma spetsiifiliste DNA järjestustega, mis külgnevad sihtkohaga. Kuid tsingi sõrme domeenide kasutamise asemel kasutavad TALENid DNA-d siduvaid domeene, mis on saadud taimepatogeenide rühma valkudest. Tehnilistel põhjustel on TALEN-e lihtsamini kohandada kui ZFN-e, eriti pikemate äratundmissaitide jaoks. Nagu ZFN-id, kannavad ka TALEN-id Fok1 domeeni, mis on sulandatud konstrueeritud DNA-ga seonduvasse piirkonda, nii et kui sihtkoht on seotud mõlemale poole, võib dimeriseeritud Fok1 nukleaas soovitud asukohas sisse viia kaheahelalise purunemise.
Erinevalt ZFNidest ja TALENidest kasutab CRISPR-Cas9 nukleaasi aktiivsuse juhtimiseks RNA-DNA järjestuse äratundmist, mitte valgu-DNA seondumist, mis lihtsustab selle kavandamist ja võimaldab selle rakendamist paljudele sihtjärjestustele. CRISPR-Cas9 saadi bakterite adaptiivsest immuunsussüsteemist. Lühend CRISPR viitab rühmitatud regulaarselt paiknevatele lühikestele palindroomsetele kordustele, mida leidub enamikus bakteri genoomides. Lühikeste palindroomsete korduste vahel on järjestuse lõigud, mis on selgelt pärit bakteriaalsete patogeenide genoomidest. Klastri proksimaalses otsas asuvad klastri distaalses otsas „vanemad” vahetükid ja „uuemad” vahetükid, mis esindavad hiljuti leitud patogeene.
CRISPR-i piirkonna transkriptsiooni tulemuseks on väikeste „suunavate RNA-de” tootmine, mis hõlmavad juuksenõelte moodustisi palindroomsetest kordustest, mis on ühendatud vahetükkidelt saadud järjestustega, võimaldades igal neist kinnituda oma vastavale sihtmärgile. Moodustunud RNA-DNA heterodupleks seostub seejärel nukleaasiga, mida nimetatakse Cas9, ja suunab selle katalüseerima kaheahelalise DNA lõhustumist sihtmärgispetsiifilise järjestuse ja palindroomse korduse ristmikul läheduses RNA-s. Kuna RNA-DNA heterodupleksid on stabiilsed ja kuna ainulaadse sihtmärk-DNA järjestusega spetsiifiliselt seonduva RNA järjestuse kujundamine nõuab ainult teadmisi Watsoni-Cricki aluspaaride moodustamise reeglitest (A seob T [või RNA-s U] ja C seob) kuni G), oli CRISPR-Cas9 süsteem eelistatav sulandvalgu kujundusele, mida on vaja ZFN-ide või TALEN-ide kasutamiseks.
Taotlused ja vastuolud.
2015. aastaks oli CRISPR-Cas9 rakendatud varajaste embrüote jaoks, et luua geneetiliselt muundatud organisme. CRISPR-Cas9 süstiti ka katseloomade vereringesse, et saavutada kudede alamrühmas oluline geeni redigeerimine. Viljakultuuride, põllumajandusloomade ja laborimudel-organismide, sealhulgas hiirte, rottide ja ahviliste genoomide modifitseerimiseks oli kasutatud CRISPR-Cas9-l põhinevaid lähenemisviise. Süsteem võimaldas luua inimmudelite jaoks loommudeleid ja eemaldada nakatunud rakkudest HIV. Inimese haiguse hiiremudelis kasutati geneetilise vea edukaks parandamiseks CRISPR-Cas9, mille tulemuseks oli haigete hiirte kliiniline päästmine. Ilmnes, et CRISPR-Cas9 geeni redigeerimisel oli vähe ületamatuid tehnilisi piiranguid, kui neid oli.
2015. aastal toetas Doudna koosseisu kuulunud teadlaste rühm CRISPR-Cas9 tehnoloogia inimeste kasutamisel vaoshoitust, vähemalt seni, kuni inimgeeni redigeerimise ohutust ja eetilisi mõjusid saab piisavalt arvesse võtta. Teised teadlased soovitasid lähenemisviisi "täielik aur edasi", väites, et uus tehnoloogia on võti paljude inimkannatuste leevendamiseks ja selle hoidmine oleks ebaeetiline. Aprilli lõpus avaldas USA riikliku terviseinstituudi (NIH) direktor Francis Collins avalduse, milles teatas, et NIH jätkab geeniredaktorisüsteemide, sealhulgas CRISPR-Cas9 uuringute rahastamist; siiski ei rahastaks NIH uuringuid, mis hõlmaksid inimese embrüote geenide redigeerimist. Mai alguseks oli Hiinast aga juba tulnud teateid inimembrüote geenitoimetamise katsete kohta. On ilmne, et CRISPR-Cas9 geeni redigeerimist kasutatakse vähemalt mõnes riigis inimese genoomi modifitseerimiseks. Selle tegevuse positiivseid ja negatiivseid tagajärgi peeti inimgeneetika tuleviku potentsiaalseks uuesti määratlemiseks.
